Bệnh đốm nâu (còn gọi là khô lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên

  Một số bệnh hại Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên do nấm

1.4.1.1.       Bệnh phồng lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên

Bệnh được phát hiện năm 1868 ở Ân Độ, nhưng đến năm 1895 Masse mới nghiên cứu phát hiện nguyên nhân gây bệnh. Bệnh do nấm Esobasidium vexans Mase gây ra [1],[4].

Bệnh phát sinh ở lá non, cành non, vết bệnh phần lớn ở mép lá. Đầu tiên trên lá xuất hiện những chấm nhỏ hình giọt dầu màu vàng nhạt. Sau đó vết bệnh lớn dần, màu nhạt dần. Phía dưới vệt bệnh (mặt dưới lá) phồng lên và mặt trên lõm xuống, phía lồi có hạt phấn màu trắng, có giới hạn rõ rệt với phần lá khoẻ. Cành bị nấm hại sẽ bị chết [50].

Đám bào tử (Basidiospore) của nấm bệnh có hình gậy, phía đỉnh phân nhánh, mỗi nhánh đính một bào tử có hình bầu dục hoặc hình thận không màu. Lúc đầu bào tử là đơn bào, về sau ở giữa có vách ngăn tạo thành hai bào tử. Bào tử rất dễ rụng.

Dưới điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ thấp bệnh phát sinh mạnh. Các thời điểm bệnh thường phát sinh mạnh là tháng 3 đến tháng 5 và tháng 9 đến tháng 10. Nhiệt độ thích hợp là 15       20°c.

1.4.1.2.      Bệnh đốm nâu

Bệnh đốm nâu (còn gọi là khô lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên hình bánh xe) là bệnh hại lá thường thấy ở các nương Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên Việt Nam. Bệnh phát sinh vào tháng 5, 6 mưa nhiều và bệnh phát sinh mạnh nhất vào tháng 8,

9. Bệnh nặng có thể làm khô lá và rụng sớm. Tác nhân gây bệnh là do nấm Colletotrichum camelliae Masse [1],[4].

Bệnh đốm nâu chủ yếu hại lá già, cành và quả. Trên lá vết bệnh bắt đầu từ mép lá, màu nâu, không có hình dáng nhất định hoặc hình bán nguyệt. Trên vết bệnh có các đường tròn đồng tâm, ở giữa vết bệnh lá bị khô, màu xám tro đen lan dần theo hình gợn sóng bánh xe. Trên cành cũng có triệu trứng như vậy, bộ phận bị bệnh có thể bị rách (vỡ) ra [50].

Bào tử nấm tồn tại trên vết bệnh và lá bệnh, thậm chí cả khi lá rơi xuống đất. Năm sau, khi nhiệt độ tăng lên, bào tử phát tán nhờ gió mưa truyền đến các lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên và sau lây nhiễm 5            18 ngày thì xuất hiện vết bệnh.

Bệnh ưa nóng ẩm nên thường phát sinh vào tháng 7, 8. Sau mưa liên tục 10   15 ngày bệnh phát ừiển rất nặng.

Ở vùng đất thấp có mực nước ngầm cao, thoát nước không tốt, phân bón không đủ đều tạo điều kiện cho bệnh phát sinh. Trong quá trình chăm sóc Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên bị xây xát nhiều, ánh sáng quá mạnh hoặc khi gặp mưa, bệnh phát sinh càng nặng, giống Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên lá to bệnh dễ phát sinh mạnh.

1.4.13. Bệnh đốm trắng

Ở Việt Nam, bệnh đốm trắng có ở mọi vùng Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên, phát sinh trên vườn Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên mới trồng, gây hại ở lá non và cành non. Mùa mưa bệnh phát sinh mạnh nhất. Tác nhân gây bệnh là do nấm Phyllosticta theafolia Hara [4].

Lúc đầu vết bệnh còn nhỏ, hình tròn, màu nâu phần giữa lõm xuống có màu trắng sáng, xung quanh có màu lông sẫm. Đuờng kính vết bệnh 0,5                                                      1,5

mm. Thời kỳ sau, nhiều vết nhỏ liên kết với nhau tạo thành vết lớn không có hình dạng nhất định, cuống lá bị bệnh dễ làm cho lá rụng. Bệnh có thể phát sinh ở tất cả cành non. Mặt trên vết bệnh có những vết nhỏ màu đen. Bệnh đốm trắng có những nốt mốc và có những vết nhỏ hình mũi kim.

Sợi nấm hoặc bào tử tồn tại trong lá bị rụng hoặc ở cành cây để qua đông. Mùa xuân bào tử phát tán và xâm nhập vào các cành non và lá bánh tẻ. Nhiệt độ từ 18     25°c rất thích hợp cho sự phát sinh của bệnh. Mùa xuân và

mùa thu, mưa nhiều là điều kiện cho sự phát sinh mạnh. Trên các giống Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên lá nhỏ (như Đại bạch trà, Gruzia) bệnh cũng phát sinh mạnh.

1.4.1.4. Bệnh đốm xám

Bệnh đốm xám là bệnh phổ biến ở các vùng trồng Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên. Bệnh phát sinh vào mùa mua, nhiệt độ 27        30°c.

Bệnh nặng làm lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên khô rụng, cây Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên còi cọc. Tác nhân gây bệnh là do nấm Pestalossia theae Sawada [1],[4].

Vết bệnh trên lá có màu nâu sẫm, lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen sau đó lan ra khắp lá. Bệnh thường bắt đầu từ mép lá và làm cho lá rụng. Vết bệnh có hình gợn sóng, trên vết bệnh có các hình vân đen. Lá thường bị rụng khi bệnh lan khắp lá hoặc 1/2 lá.

Những điểm nhỏ trên lá là bào tử phân sinh đính trên cuống ngắn và đính bào tử. Bào tử có 3 ngăn, đầu nhỏ có cuống, đầu lớn có 3 lông, bào tử màu nâu xẫm.

1.4.1.5.       Bệnh thối búp Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên

Bệnh thối búp Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên thường thấy ở các nước trồng Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên của vùng Châu Á.

Bệnh này được phát hiện ở Phú Hộ từ năm 1961 - 1962 trên những nương Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên tăng sản và lấy hom giống. Tác nhân gây bệnh là do nấm Colletotrichum theae Petch [4].

Bệnh thường xuất hiện ở lá non, cuống lá và cành non. Vết bệnh lúc đầu bằng đầu kim có màu đen, sau đó lan dần ra hết cả búp và cành Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên. Sau 8   10 ngày vết bệnh có thể dài tới 15            20 mm. Khi thời tiết nóng ẩm lá dễ

bị rụng. Trong vườn ươm thường hay bị nặng hơn ở nương Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên hái búp. Từ tháng 7 đến tháng 9 thường có mưa kéo dài, bệnh dễ gây hại nặng. Nhiệt độ 27⁰C và độ ẩm > 90% là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh. Bào tử nấm lan truyền nhờ mưa gió. Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên để cành và vườn ươm bón nhiều phân đạm và trên nền thâm canh cao, thường bị bệnh nặng hơn.

1.4.2.      Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật * Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật

Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã điều tra nghiên cứu tình hình sử dụng CKS trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật. Tuy còn ở mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông nghiệp hiện đại.

Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm
rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây. Thông thường, một lo ại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài lo ại nấm gây bệnh nhưng có những loài ho ạt phổ rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất.

Không phải tất cả các xạ khuẩn có ho ạt tính kháng nấm invitro đều th ể hiện trong đất (khoảng 4 - 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh. Xạ khu ẩn chống nấm ngoài việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ VSV thông qua các enzym phân giải. Ngoài ra, nhiều XK còn tiết ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ [14].

* Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật

Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta có thể sử dụng một số biện pháp kỹ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại.

Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khu ẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ dại... kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc hóa học, dùng các CKS trong b ảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học. CKS và dịch lên men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất [15].

Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ân Độ...Ở Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng xạ khuẩn từ đất và nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn.

Năm 2002, ở Ân Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F. so/a«i...[15].

Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricu/aria oryzae gây bệnh đạo ôn và F. oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật [2]. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.

Ngoài ra, giá thành của các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với đ iều kiện sản xuất của người nông dân. Do đó cần có sự phối hợp thống nh ất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả to lớn trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người [14].

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

•

2.1       NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

2.1.1.           Nguyên liệu

2.1.1.1        Mẫu cây

Mẫu nghiên cứu là các lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên, búp Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên bị bệnh thu thập từ các địa điểm khác nhau của Thái Nguyên, được bảo quản trong tủ lạnh không quá 24 giờ.

2.1.1.2.        Mẫu đất

Các mẫu đất được lấy ở các độ sâu 5 - 10 cm t ại các địa điểm khác nhau của tỉnh Thái Nguyên.

2.11.3.          Vi sinh vật kiểm định

Ngoài các chủng nấm phân lập được từ các lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên bị bệnh, 3 chủng nấm gây bệnh thực vật được sử dụng làm VSV kiểm định là:

-      Rhizoctonia solani VCM 3047

-      Fusarium oxysporum VCM 3028

-      Fusarium moniliforme VCM 3027

Các chủng nấm này nhận được từ phòng Di truyền VSV - Viện Công nghệ S inh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.1.21. Hóa chất

-    Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose... của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất

-                    Các loại muối: K₂HPO₄, KH₂PO₄, KI, MgSO₄. 7H₂O, KNO₃, NaCl, FeSO₄. 7H₂O, (NH₄)₂SO₄, CaCO₃, MnCl₂, Na₂CO₃, ZnCl₂, ZnSO₄.... nhập từ Trung Quốc, Anh sản xuất

-   Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone... của hãng Merck (Đức).

-   Các lo ại hóa chất khác: thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)... của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất.

-                              Các dung môi: etanol, iso-propanol, metanol, aceton.. của Trung Quốc.

21.2.2.       Dụng cụ và thiết bị

KHVQH Olympus (Nhật) KHVĐT Joel (Nhật)

Máy lắc (Hàn Quốc)

Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ)

-      Máy ly tâm Hettich (Đức)

-                              Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đúc, Việt Nam...

2.1.2.3.     Các công thức môi trường

Môi trường phân lập và giữ giống nấm

*Môi trường CZ (Czapek - Dox - Agar) (g/l)

NaNO₃ - 2; KH₂PO₄ - 1; MgSO₄. 7H₂O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO₄ - 0,01; Thạch - 20; H₂O - 1lít

*Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l)

Khoai tây miếng - 200; Thạch - 18; đường - 20, H₂O 1lít; pH 7 - 1,4. Môi trường phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn

* Môi trường Gause -1 (g/l)

Tinh bột tan - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4. 7H₂O - 0,5; NaCl - 0,5; (NHO2SO4 - 2; KNO3 - 0,5; FeSO4 - 0,01; Thạch - 18 g; H2O - 1lit; pH 7 - 7,4.

*      Môi trường Gause - II (g/l)

Nước chiết thịt - 30ml; pepton - 5; NaCl - 5; glucoza - 10; Thạch - 18g; H₂O - 1lít; pH 7 - 7,4.

*      Môi trường ISP -1 (g/l)

Trypton - 5, cao nấm men - 3; thạch - 18; H₂O - 1lít; pH 7 - 7,2.

*      Môi trường ISP -2 (g/l)

Cao nấm men - 3; Cao malt - 10; Dextrose - 4; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH 7 - 7,2.

*      Môi trường ISP - 3 (g/l)

Bột kiều mạch - 20; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH - 7,2.

*      Môi trường ISP - 4 (g/l)

Tinh bột tan - 10; K₂HPO₄ - 1,0; MgSO₄. 7H₂O - 1,0; NaCl - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 2; CaCO₃ - 2; dung dịch khoáng - 1ml; thạch - 18g; H₂O - 1lít; pH 7 - 7,2.

*      Môi trường ISP - 5 (g/l)

Asparagin - 1; Glixerin - 10; K₂HPO₄ - 1; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH 7,0 - 7,4.

*      Môi trường ISP - 6 (g/l)

Peptone - 10; cao nấm men - 1; xitrat sắt - 0,5; thạch - 18; H₂O - 1lít; pH 7 - 7,2.

*      Môi trường ISP - 7 (g/l)

Glycerol - 15; L - tyrosine - 0,5; L - asparagine - 1; FeSO₄.7H₂O - 0,01; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄. 7H₂O - 0,5; Nacl - 0,5; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH 7,2 - 7,4.

*      Môi trường ISP - 9 (g/l)

(NHO2SO4 - 2,64; KH2PO4 - 2,38; K2HPO4 - 5,65; MgSO4 - 1; dung dịch muối B - 1ml; nguồn cacbon - 10; thạch - 20; H₂O - 1lít; pH 6,8 - 7.

-     Dung dịch muối A (%): FeSO₄ - 0,1; ZnSO₄ - 0,15; MnCl₂ - 0,1; Nước cất - 100ml.

-                     Dung dịch muối B (%): CuSO₄ - 0,64; FeSO₄ - 0,11; MgCl₂ - 0,79; nước cất - 100ml.

*      Môi trường 79 (g/l)

Glucoza -10; peptone -10; cazein thủy phân - 2; cao nấm men - 2; NaCl - 6, K2HPO4 - 0,2; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,4.

*      Môi trường A4 - H (g/l)

Glucoza - 15; bột đậu tương - 15; NaCl - 5; CaCO₃ - 1; H₂O - 1lít; pH 7.

*      Môi trường A - 4 (g/l)

Glucoza - 10; bột đậu tương - 10; NaCl - 5; CaCO₃ - 1; H₂O - 1lít; pH 7.

*      Môi trường Tinh bột (g/l)

Tinh bột - 20; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄ - 0,5; KNO₃ - 1; NaCl - 0,5; FeSO₄ - 0,01; Agar - 30,0; Nước - 1 lít; pH 7,2 - 7,4.

*      Môi trường Czapek Glycerin (g/l)

Glycerin - 30,0; NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1.0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Agar - 20,0; Nước - 1 lít.

*      Môi trường Czapek Gluco (g/l)

Gluco - 30,0; NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1.0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Agar - 20,0; Nước - 1 lít.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.        Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên

Chọn các mẫu Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên có triệu chứng điển hình, mới. Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vòi nước,cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp. Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên bằng cồn (etanol 70%) trong vòng 3 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng, thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng dao mổ vô trùng cắt các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khỏe). Dùng panh vô trùng đặt các mảnh mô nhỏ trên vào môi trường Czapek trên đĩa petri. Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: ngày, cây, bệnh.. Để đĩa môi trường đã đặt mẫu trong t ủ ấm 30⁰C. Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp: PDA hoặc

CZ. Thu nhận giống thuần khiết trong ống thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở 4⁰C [14].

2.2.2.      Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

2.2.2.1.      Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

Cân 1g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml d ịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10^-2, 10^-3... 10^-6. Từ mỗi nồng độ pha loãng ở các nồng độ 10^-3 đến 10^-6, nhỏ 0,1ml sang đĩa Petri chứa môi trường Gause - I. Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 - 7 ngày. Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy 3 pha sang đĩa Petri chứa môi trường Gause - I để làm sạch. Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause - I, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10 - 14 ngày [12].

Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng xạ khu ẩn được chia thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm tr ắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X) [16],[19], [42].

2222. Xác định hoạt tính kháng sinh

Phương pháp thỏi thạch (dùng để sơ tuyển Xạ khuan)

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 4 hoặc Gause - I trong đĩa petri sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định. Sau đó để vào tủ lạnh 4 - 5h cho CKS khuếch tán vào môi trường thạch sau đó để vào tủ ấm. VSV kiểm định nuôi ở 28 - 30⁰C, đọc kết quả sau vài ngày [7].

HTKS được xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D - d, mm), D là kích thước vòng vô khuẩn và d là đường kính thỏi thạch.

Phương pháp đục lô (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể)

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định trong đĩa petri. Nhỏ vào các lỗ khoan dung d ịch cần thử (các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch).

Ph ương pháp khoanh giấy lọc (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dung môi) Khoanh giấy lọc F8 có đường kính 6mm được tẩm một lượng dịch CKS (1ml/10 khoanh giấy lọc). Sau đó sấy khô ở 40⁰C, đặt khoanh giấy lọc đã tẩm CKS vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định (các bước tiếp theo giống phương pháp thỏi thạch).

2.2.23. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Từ ống thạch nghiêng giống đã ho ạt hóa được cấy truyền sang các bình nón dung tích 250 ml chứa 100 ml môi trường Gause - I và nuôi lắc 220 vòng/ phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng.

Giống phát triển được cấy truyền với tỷ lệ 10% sang bình nón dung tích 250 ml chứa 80 ml môi trường Gause - I dịch thể. Quá trình lên men kéo dài 96 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 220 vòng /phút. Sau đó thử HTKS trong dịch lọc [7].

2.2.3.        Bảo quản giống

Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn được cấy trên môi trường thạch nghiêng Gause - I ở nhiệt độ phòng. Sau 10 - 14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt, các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 6⁰C. Sau 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần.

Để bảo quản lâu giống được giữ trong ống cát, trong parafin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được 6 tháng đến 2 năm.

2.2.4.        Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

2.2.4.I.          Đặc điểm hình thái

Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh

Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh...

Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất

Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa ho ặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).

Quan sát cuống sinh bào tử

Xạ khu ẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause - I có găm lamen nghiêng 45⁰ trên bề mặt môi trường. Sau 7 - 9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay hơ i lượn sóng ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xo ắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales) [33], [35], [41]. Quan sát bề mặt bào tử

Dùng màng cacbon đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử, sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét. Bào tử có các hình dạng: tròn, ovan, elíp, hình que [33].

Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairy).

2.2.4.2.        Đặc điểm nuôi cấy

Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường: Gause - I, Gause - II, ISP - 1, ISP

-      2, ISP - 3, ISP - 4, ISP - 5, ISP - 6, ISP - 7 ở nhiệt độ phòng. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường [33], [37].

Sự hình thành sắc tố melanin

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 6 ở nhiệt độ phòng. Bắt đầu quan sát màu của môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14. Nếu sinh melanin, màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng nh ạt sang màu nâu đậm cho đến màu đen [33].

2.2.4.3.         Đặc điểm sinh lý - sinh hóa Khả năng sinh enzym ngoại bào

-      Chiết d ịch enzym

Thu enzym từ môi trường lỏng: xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi tr ường Gause II dịch thể sẽ được lọc bỏ sinh khối ho ặc ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 15 phút, chiết dịch trong thì thu được enzym thô.

-       Xác định ho ạt tính các enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau:

-      Tinh bột tan (xác định ho ạt tính amylaza)

-      Cazein (xác định ho ạt tính proteaza)

-      CMC (xác định ho ạt tính endoglucanaza).

Chuẩn b ị môi trường cơ chất - thạc h gồm: 20g thạch + 2 - 10g cơ chất, pha môi trường trong 1000 ml nước. Thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút. Đổ môi trường vào các đĩa Petri sao cho bề dày lớp th ạch kho ảng 3 mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dung dịch enzym cần thử và 0,2 ml nước làm đối chứng, để ở tủ lạnh 4⁰C kho ảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 30⁰C trong 24 giờ [23].

Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D - d (mm). Sau khi nhuộm màu đỏ Công gô (c ơ chất CMC), axit tricloaxetic (cơ chất casein) và thuốc thử Lugol (cơ chất tinh bột). Vùng cơ chất bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch.

Khả năng chịu muối

Cấy xạ khuẩn trên môi trường th ạch nghiêng ISP - 1 có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ 0,5; 3; 7; 9; 11; 12 (%). Sau 7 - 10 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng.

Khả năng sử dụng các nguồn cacbon

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 9 có bổ sung 1% các nguồn đường: Glucoza, maltoza, fructoza, lactoza, sacaroza....

Cách làm: Cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung vào 100ml môi trường ISP - 9 còn nóng. Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuôi cấy xạ khuẩn ở nhiệt độ 28 -30⁰C, sau 14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đối chứng [33].

Trong đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi trường không có đường được coi là đối chứng âm (-).

-     Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng ho ặc kém hơn đối chứng dương một ít: có khả năng sử dụng loại đường đó. ký hiệu là (+).

-      Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, ký hiệu là (++)

-     Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc: không có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu là (-).

-     Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém hơn đối chứng dương nhiều, ký hiệu là (±).

2.2.5.          Lên men tạo kháng sinh

2.2.5.1.        Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Xạ khu ẩn được lên men trên các môi trường cơ bản (theo Porter) là:

A - 4, A - 4H, A - 9, ISP - 4, Gause - I và Gause - II. Sau 96 giờ nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định HTKS trong dịch lên men (phương pháp đục lỗ) và sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn ra môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [34].

2.2.5.2.        Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Bổ sung nguồn cacbon (%): Tinh bột tan 1 và 2; glucoza - 1,5; lactoza - 1,5; sacaroza - 1,5; rỉ đường - 1,5; vào hỗn hợp dung d ịch muối (dung d ịch muối A) đã bổ sung 0,2 % (NHO2SO4.

Bổ sung giống và lên men trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/ phút. Sau 96 giờ lên men xác định HTKS trong dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ thạch.

2.2.5.3.        Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Bổ sung nguồn Nitơ (%): Cao nấm men, bột đậu tương, (NHị)₂SO₄ và KNO₃ vào hỗn hợp dung dịch muối đã bổ sung thêm 1,5% glucoza. Sau đó bổ sung giống rồi lên men và thử HTKS bằng phương pháp đục lỗ.

2.2.6.          Các phương pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA

2.2.6.1.        Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB Nguyên tắc:

Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn nhờ lyzozym. Loại bỏ protein khỏi DNA nhờ các enzym protease K. Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ thành hai pha nhờ dung dịch đệm chlorofom: isoamyl alcohol (24:1): pha trên chứa cặn tế bào, pha dưới chứa axit nucleic. Sau cùng, DNA được tủa bằng ethanol tuyệt đối (đã được làm lạnh - 22), được làm khô và hòa tan trong đệm TE [39].

Tiến hành:

Lấy 1,5ml dịch nuôi cấy tế bào đem ly tâm tốc độ 3000 vòng/ phút trong 30 phút để thu cặn tế bào.

Hòa tan cặn tế bào trong 0,8 ml TE 25S, lắc đều bằng vontex. Bổ sung 40 pl lysozym, ủ ở 37⁰C trong 90 phút (nồng độ cuối cùng của lysozym là 2mg/ ml).

Bổ sung 10 pl protease K, mix đều, thêm 60 pl 10% SDS, đảo nhẹ, ủ 1giờ ở nhiệt độ 55⁰C (nồng độ cuối cùng của protease K là 0,18mg/ml, SDS là 0,5%).

Bổ sung 150 pl NaCl 5M, mix đều. Sau đó bổ sung 130 pl CTAB, mix đều, ủ 10 phút ở 55⁰C.

Đặt ở nhiệt độ phòng 5 phút, chia đều ra 2 ống eppendorf mới. Sau đó bổ sung vào mỗi ống 700 pl chlorofom/ isoamyl alcohol, mix đều 15 phút. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 20 phút để tách pha.

Chuyển dịch pha trên sang các eppendorf mới và bổ sung 0,6V isopropanol, đảo nhẹ. Đặt trong tủ - 20⁰C trong 30 - 40 phút. Ly tâm 9000 vòng/phút, rửa tủa bằng etanol 70%. Hòa tan DNA trong 100 pl TE.

2.2.6.2.        Khuếch đại gen rRNA - 16S bằng phản ứng PCR Nguyên tắc.

PCR là phản ứng trùng hợp, cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể lên hàng triệu lần nhờ sự xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt. Enzym này có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao. Sự hoạt động của enzym được kiểm soát của một chu kỳ nhiệt xác định. Đoạn DNA được tổng hợp được giới hạn về mặt kích thước bởi một cặp mồi đặc hiệu.

Cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu có trình tự là:

Trình tự mồi: Mồi xuôi 27             5 - agagtttgatcctggctcag - 3             27- 47

Mồi ngược 1525 5 - aaaggaggtgatccagcc - 3                   1525 -1507

Tiến hành:

Thành phần phản ứng	Chu kỳ nhiệt
H2O 17,1pl Buffer (10X) 2,5pl dNTP (2,5mM) 2pl Primer 1 (10pml) 1pl Primer 2 (10pml) 1pl ADN khuôn 1pl Enzyme Taq 0,4pl	940C 3 phút 940C 1 phút 640C 1 phút 720C 1 phút 30 giây 40C »
Tổng 25pl

 

2.2.5.3.      Phương pháp điện di trên gel agarose

Phương pháp điện di trên gel agrose được sử dụng để kiểm tra DNA plasmid, kiểm tra các phân đoạn DNA được nhân bằng kỹ thuật PCR và kiểm tra kết quả cắt giới hạn. Phương pháp này được chia làm một số bước như sau:

-   Chuẩn bị gel agarose: cân một lượng agarose tương ứng (tùy theo nồng độ gel yêu cầu) vào trong dung dịch 100ml TAE 1X. Đun sôi bằng lò vi sóng, để nguội xuống khoảng 50⁰C rồi đổ dung dịch vào bản gel đã cài sẵn lược. Sau khoảng 30 phút, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch điện di TAE ngập bản gel.

-     Tra mẫu: lấy 1 - 2 g DNA pha loãng trong 16 1 đệm TE, sau đó bổ sung 4 1 dye mầu. Một luợng DNA maker tuơng ứng cũng đuợc tra vào bản gel trước khi điện di.

-     Điện di: Điện di tại hiệu điện thế không đổi 100V trong khoảng 20 - 30 phút. Quan sát sự di động của DNA từ cực âm sang cực dương thông qua d ye mầu.

- Nhuộm bản gel: Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm EtBr nồng độ 2 g/ml trong khoảng 10 phút, lắc nhẹ trên máy lắc, sau đó soi gel trên đèn UV và chụp ảnh bằng máy chụp gel của hãng Bio - Rad.

2.2.7.        Phương pháp xử lý số li ệu

Kết quả nghiên cứu được chúng tôi xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel.