Trà Tân Cương Thái Nguyên bị bệnh thu thập ở các khu vực khác nhau của tỉnh Thái Nguyên

Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên

Từ các mẫu Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên bị bệnh thu thập ở các khu vực khác nhau của tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 3 chủng nấm được ký hiệu là CT - 1A, CT - 2E và CT - 5X.

Các chủng nấm phân lập được đều có đặc điểm chung là: các sợi nấm đều không có màu sắc, sợi nấm có vách ngăn (hình 3.1). Mỗi chủng nấm được phân lập từ một mẫu Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên có biểu hiện bệnh khác nhau. Kết quả được trình bày trên bảng 3.1.

Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên làm nguồn phân lập các chủng nấm

Ký hiệu chủng nấm	Nguồn phân ^lập	Biểu hiện bệnh
CT - 1A	Lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên non	Trên bề mặt lá và mép lá có nhiều đốm nâu
CT - 2E	Lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên non	Vết bệnh có màu nâu sầm, lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen, sau đó lan ra khắp lá.
CT - 5X	Lá Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên non	Các lá bị xo ăn, trên mặt lá có thể bị nhăn.

Sau khi được tinh sạch, 3 chủng nấm trên được giữ trong ống thạch nghiêng trên môi trường Czapek và được sử dụng làm VSV kiểm định để tuyển chọn xạ khu ẩn sau này.


	$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image5.jpeg$

Chủng CT - 5X

Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên bị bệnh

3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn

Từ các mẫu đất lấy ở độ sâu 5 - 10 cm tại các địa điểm khác nhau thuộc tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Sau khi thử HTKS theo phương pháp khuếch tán trên thạch với 3 chủng nấm CT - 1A, CT - 2E, CT - 5X, chúng tôi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng trong tổng số 80 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. So sánh với tỷ lệ chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công bố trước đây cùa Lê Gia Hy và cộng sự [18], tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên của chúng tôi có phần cao hơn.

Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu

Nhóm màu xạ khuẩn	Các chủng có HTKN		Tỷ lệ chủng có HTKN so với tông số (%)
Nhóm màu xạ khuẩn	Số lượng	Tỷ lệ(%)	Tỷ lệ chủng có HTKN so với tông số (%)
Trăng (Allbus)	11	36,7	13,7
Xám (Griseus)	8	26,7	10,0
Xanh (Azeureus)	7	23,3	8,6
Hồng (Roseus)	2	6,7	2,6
Nâu (Chromogenes)	1	3,3	1,3
Lục (Viridis)	1	3,3	1,3
Tông cộng	30	100	37,5

Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm phân chia theo nhóm màu của S hirling và Gottlieb [37]. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.2.

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image6.jpeg$

Xám Trâng Xanh Hông Nảu Lục

Nhóm màn

Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu

Kết quả trên bảng 3.2 cho thấy: số lượng chủng có hoạt tính nhiều nhất là nhóm trắng chiếm 36,7%, sau đó là nhóm xám - 26,7%, nhóm xanh - 25,3%, nhóm hồng - 6,7% và ít nhất là các nhóm nâu và lục đều chiếm 3,3%. Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp với những nghiên cứu của một số tác giả trước đây [14],[18].

Đồng thời chúng tôi cũng nhận thấy khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên có sự khác nhau (bảng 3.3).

Bảng 3. 3. T ính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trê n Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên

Chủng XK có HTKN	3 chủng nấm gây bệnh Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên
Chủng XK có HTKN	CT - 1A	CT - 2E	CT - 5X	Kháng cả 3 chủng
Số lượng	9	16	13	4
Tỷ lệ (%)	30	53	43	13,3

Trong tổng số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, số chủng kháng nấm CT - 2E là cao nhất, có 16 chủng (chiếm 53% ), tiếp theo là số chủng kháng nấm CT - 5X, có 13 chủng (chiếm 43%) và ít nhất là chủng kháng nấm CT - 1A có 9 chủng (chiếm 30%).

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image7.jpeg$

Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm

Đáng chú ý trong số đó, có 4 chủng có khả năng kháng được cả 3 chủng nấm, chiếm tỷ lệ 13,3%, các chủng còn lại phần lớn chỉ kháng được 1 đến 2 chủng nấm. Tỷ lệ các chủng kháng nấm được thể hiện trên hình 3.3.

3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao

Sau khi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất được ký hiệu là: Đ1 và R2. Ở bước này, các chủng được nuôi lắc trong môi trường d ịch thể ISP - 4 để thu dịch nuôi cấy. Kết quả kiểm tra hoạt tính của dịch nuôi cấy theo phương pháp đục lỗ với các chủng nấm như trên được thể hiện trên bảng 3.4 và hình 3.4.

Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 3 chủng xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn	Hoạt tính kháng nấm (D- d, mm)
Chủng xạ khuẩn	CT - 1A	CT - 2E	CT - 5X
Đ1	12	14	15
R2	12	16	17

Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy: mặc dù cả 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn đều vẫn giữ được hoạt tính kháng nấm, song mức độ kháng đối với các chủng nấm có sự khác nhau. Khả năng kháng nấm CT - 1A của cả 2 chủng xạ khuẩn đều yếu nhất và khả năng kháng chủng CT - 5X của 2 chủng xạ khu ẩn là cao nhất.

Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân lo ại của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2. Hai chủng xạ khu ẩn này thuộc hai nhóm màu khác nhau. Chủng Đ1 thuộc nhóm màu trắng và chủng R2 thuộc nhóm màu nâu.


	$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image8.jpeg$

VSV kiểm định: CT - 5X VSV kiểm định: CT - 2E

Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn

3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2

3.3.1. Đặc điểm hình thái



			$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image9.jpeg$

Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có dạng gai. Chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì.

Hình 3. 5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image10.jpeg$

Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1

3.3.2. Đặc điểm nuôi cấy

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để quan sát khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn và màu sắc của hệ khuẩn ty. Kết quả cho thấy xạ khuẩn rất đa dạng về màu sắc khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau. Tùy theo thành phần của môi trường nuôi cấy mà màu sắc khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh hay sắc tố hòa tan tiết ra khác nhau. Các đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng R2 và Đ1 được trình bày trên bảng 3.5 cho thấy:

Đối với chủng Đ1: khi nuôi cấy trên các môi trường ISP - 1, ISP - 2, ISP - 3, ISP - 5, ISP - 7 màu sắc của KTKS và KTCC đều có màu trắng. Trên môi trường ISP - 4 màu sắc HSCC có màu xám và HSKS có màu trắng. Ở môi trường ISP - 6 màu sắc của HSKS có màu vàng và HSCC có màu trắng.

Đối với chủng R2: màu sắc của HSCC và HSKS có đa dạng hơn khi nuôi cấy trên các môi trường ISP khác nhau.

Môi	Chủng Đ1			Chủng R2
trường	HSCC	HSKS	Sằc tố	HSCC	HSKS	Sắc tố
ISP - 1	Trằng	Trằng	Không màu	Nâu	Trằng	Không màu
ISP - 2	Trằng	Trằng	Không màu	Nâu	Xám ghi	Không màu
ISP - 3	Trằng	Trằng	Không màu	Trằng ngà	Xám ghi	Không màu
ISP - 4	Xám	Trằng	Không màu	Trằng	Xám	Không màu
ISP - 5	Trằng	Trằng	Không màu	Trằng ghi nâu	Trằng ghi xanh	Không màu
ISP - 6	Trằng	Vàng	Không màu	Nâu	Xám ghi (yếu)	Melanin
ISP - 7	Trằng	Trằng	Không màu	Nâu	Xám ghi	Nâu

* Khả năng hình thành sắc tố melanin

Chủng R2 và Đ1 được nuôi cấy trên môi trường ISP - 6 ở nhiệt độ 30⁰C. Sau 14 ngày quan sát chúng tôi nhận thấy:

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image11.jpeg$

Chủng R2 Chủng Đ1

Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng

Đối với chủng Đ1 màu sắc của môi trường không có sự biến đổi, tức là không có khả năng hình thành sắc tố melanin.

Đối với chủng R2 màu sắc của môi trường biến đổi từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm, điều đó có nghĩa là chủng R2 có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt.

3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa * Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon

Để đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau, chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng R2 và Đ1 trên môi trường ISP - 9 có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ 1%. Sau 7 - 14 ngày nuôi cấy, kết quả được thể hiện trên bảng 3. 6.

Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2

Nguồn cacbon	Mức độ sinh trưởng
Nguồn cacbon	Chủng Đ1	Chủng R2
Glucose	++++	++++
Saccharose	++++	++
Fructose	++++	++
Lactose	-	++++
Manitol	++++	++++
Dextrin	++	++++
Cellulose	+	+
Arabinose	-	+++

Ghi chú: ++ ++.• Sinh trưởng rất tốt; +++: Sinh trưởng tốt;

+ + : Sinh trưởng yếu; + : Sinh trưởng rất yếu; -:Không sinh trưởng

Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy:

Cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều có khả năng đồng hóa tốt các nguồn cacbon khác nhau. Song chủng R2 đồng hóa tốt nh ất nguồn cacbon là: Glucose, Lactose, Manitol, Dextrin và sinh trưởng yếu nhất trong môi tr ường có chứa nguồn cacbon Cellulose.

Đối với chủng Đ1 có khả năng đồng hóa tốt nguồn cacbon Glucose, Saccharose, Fructose, Manitol và không có khả năng đồng hóa 2 nguồn cacbon là Lactose, Arabinose.

* Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp

Chủng R2 và Đ1 được nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau. Khả năng sinh trưởng của 2 chủng được thể hiện trên bảng 3.7.

Bảng 3. 7: Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp của 2 chủng XK

\Nhiệt độ Chủng.	25⁰	28⁰	30⁰	32⁰	35⁰	40⁰
R2	+	+++	+++	++	+	+
Đ1	++	+++	+++	+	+	-

---------- ¹-------- ¹-------- ¹-- / ¹------------- ¹-------- ¹-------- ¹

Ghi chú: +++.• Sinh trưởng tót; + + : Sinh trưởng bình thường;

+ : Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng.

Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy, hai chủng R2 và Đ1 có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 25⁰ - 32⁰C, chủng R2 sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 28⁰ - 30⁰C và sinh trưởng yếu ở nhiệt độ 35⁰ - 40⁰C. Chủng Đ1 cũng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 28⁰ - 30⁰C và không sinh trưởng ở nhiệt độ 40⁰C. Như vậy nhiệt độ thích họp cho cả 2 chủng phát triển tốt là 28 - 30⁰C.

* Khả năng chịu muối

Hai chủng R2 và Đ1 đưọc nuôi cấy trong môi trường IS P - 1 có bổ sung NaC l ở các nồng độ 0,5; 3; 7; 9; 11; 12 và 0% đối chứng. Kết quả thu đưọc ở bảng 3.8.


	$Text Box: Nồng độ NaCl X\(%) Chủng 0,5 3 5 7 9 12 0 R2 +++ + ++ + + - - Đ1 +++ ++ + + + - - 7 Ghi chú: +++: Sinh trưởng tót; + + : Sinh trưởng bình thường;$

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image12.jpeg$ + : Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng.

Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn. Kết quả trình bày trên bảng 3.8 cho thấy: cả 2 chủng đều có khả năng sử dụng nồng độ muối tới 9% , ở nồng độ muối cao hơn thi cả 2 chủng đều không phát triển được. Như vậy ở nồng độ muối 0,5% chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 đều có tác dụng kích thích sự sinh trưởng.


	$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image14.jpeg$

* Khả năng sinh enzym ngoại bào

• (

Casein

Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn

Trong quá trình sống, để phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản có thể hấp thu được. Xạ khuẩn có khả năng tiết vào môi trường các enzym ngoại bào.

Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng này của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu, kết quả được thể hiện trên hình 3.8 cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn đều có khả năng thủy phân mạnh casein, tinh bột và CMC.

3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1

Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn cũng là một trong các chỉ tiêu phân loại. Cùng với việc nghiên cứu khả năng kháng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên. Chúng tôi cũng kiểm tra khả năng kháng một số chủng nấm kiểm định gây bệnh thực vật như đã nêu trong mục 2.1.1.3. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.9 và hình 3.9.

Bảng 3.9: Ho ạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm

kiểm định

Chủng xạ khuẩn	Hoạt tính kháng sinh (D - d, mm)
Chủng xạ khuẩn	F. oxysporum	F. moniliforme	R. solani
R2	22	15	17
Đ1	18	19	0

Kết quả trên bảng 3.9 cho thấy: chủng R2 có phổ ức chế các VSV kiểm định khá rộng, có khả năng kháng cả 3 loại nấm. Tuy nhiên chủng R2 có khả năng kháng nấm F. oxysporum là mạnh nhất với vòng ức chế là 22 mm, còn với nấm R. solani là 17 mm và nấm F. moniliforme là 15 mm (hình 3.9).

Chủng Đ1 chỉ có hoạt tính chống nấm F. oxysporum và F. moniliforme mà không có khả năng kháng nấm R. solani.

Khả năng đối kháng các chủng VSV cùng với các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa được dùng để tham khảo trong phân loại các chủng xạ khuẩn này.

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 không chỉ có khả năng kháng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên mà cũng có khả năng kháng cả các nấm gây bệnh thực vật như F. oxysporum, F. moniliforme, R. solani.

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image15.jpeg$

F. oxysporum F. moniliforme

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image16.jpeg$

R. solani.

Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2

* Phân loại chủng R2

Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis

Đặc điểm phân loại		Chủng R2	Loài chuân S. misawaensis
Hình thái	Hình dạng cuống sinh bào tử	Xoắn (S)	Xoắn (S)
Hình thái	Bề mặt bào tử	Có gai ngắn	Có gai ngắn
Môi trường ISP - 6	Khả năng sinh melanin	Có	Có
Môi trường tinh bôt	Màu KTCC	Vàng nâu	Vàng hoặc vàng nâu
	Màu KTKS	Xám	Xám hoặc xám trắng
	Sắc tố tan	Vàng nhạt	Vàng đến vàng nâu
Môi trường Czapek Glycerin	KTCC	Nâu ghi	Nâu ghi
	KTKS	Trắng hồng	Trắng hồng
	Sắc tố tan	Melanin	Melanin
Sinh kháng sinh		Có	Acwaimycin

Đối chiếu với khóa phân loại xạ khuẩn của Gause, 1983 [49]. Chúng tôi nhận thấy chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài S. misawaensis. Kết quả so sánh các đặc điểm của chủng R2 với loài S. misawaensis được trình bày trên bảng 3. 10.

Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xo ắn, bề mặt bào tử có gai ngắn. Khi nuôi cấy trên các môi trường tinh bột màu sắc KTCC từ màu trắng đến vàng nâu, còn màu sắc KTKS biến đổi thành màu xám ho ặc xám trắng. Trên môi trường Czapek Glycerin màu sắc của KTKS từ màu tr ắng biến đổi thành màu trắng hồng, còn KTCC biến đổi thành màu nâu ghi. Chủng R2 có khả năng sinh sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt.

Khi so sánh các đặc điểm phân loại của chủng R2 với loài chuẩn S. misawaensis trong khóa phân loại của Gauze, 1983. Chúng tôi nhận thấy chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài này về hình thái, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử, đặc điểm nuôi cấy, khả năng hình thành sắc tố melanin và CKS.

Như vậy, chủng R2 rất có thể thuộc loài S. misawaensis, nhóm Cinereus, seri: chromogenes. Chủng này được Hamada et Okami, mô tả vào năm 1968c [28].

* Phân loại chủng Đ1

Đặc điểm phân loại của chủng Đ1 được thể hiện trên bảng 3.11 cho thấy: chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì.

Khi nuôi cấy trên môi trường Gause - I, màu sắc của KTCC từ màu vàng nhạt biến đổi thành màu vàng nâu, màu sắc KTKS có màu trắng. Trên môi trường Gause - II, màu sắc của KTKS từ màu vàng biến đổi thành màu nâu, KTCC không có màu. Trên môi trường Czapek Glucoza, màu sắc của KTCC từ màu trắng biến đổi thành màu nâu vàng, màu của KTKS có màu trắng ánh kem. Chủng Đ1 không có khả năng hình thành sắc tố melanin.

Đối chiếu với khóa phân loại của Gauze, 1983, chúng tôi nhận thấy chủng Đ1 có nhiều đặc điểm giống với loài Actinomyces brunneofungus về các đặc điểm hình thái, cuống sinh bào tử, khả năng hình thành sắc tố melanin và đặc điểm nuôi cấy, khả năng hình thành CKS chống nấm.

Như vậy, có thể chủng Đ1 thuộc loài A. brunneofungus, nhóm Albus, seri: albocolorabus. Chủng này được Krasilnikov et al, mô tả vào năm

1971 [48].

Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A.brunneofungus

Đặc điểm phân loại		Chủng Đ1	Loài chuân A.brunneofungus
Hình thái	Hình dạng cuống sinh bào tử	Thẳng (RF)	Thẳng và lượn sóng
Hình thái	Bề mặt bào tử	Xù xì	Xù xì
Môi trường ISP - 6	Khả năng sinh melanin	Không	Không
Gauze - I	Màu KTCC	Vàng nâu	Vàng nâu
	Màu KTKS	Trằng	Trằng
	Sắc tố tan	Không	Không có
Gauze - II	Màu KTCC	Không màu	Không màu
	Màu KTKS	Nâu	Nâu
	Săc tố tan	Không	Không
Czapek gluco	Màu KTCC	Nâu vàng	Nâu hoặc nâu vàng
	Màu KTKS	Trằng ánh kem	Trằng ánh kem
	Săc tố tan	Yêu	Yêu
Sinh kháng sinh		Có	Flavofungina

3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn

3.4.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Trong công nghệ lên men, môi trường lên men đóng vai trò quan trọng. Một môi trường lên men tốt phải là môi trường vừa thuận lợi cho chủng sinh

trưởng tốt vừa cho hiệu suất kháng sinh cao. Để lựa chọn môi trường lên men đáp ứng được cả hai điều kiện trên, chúng tôi sử dụng 5 loại môi trường lên men cơ sở là: A - 4H, A - 4, Gause - I, Gause - II và ISP - 4.

Quá trình lên men được tiến hành trong bình nón dung tích 250 ml có chứa 25ml môi trường. Sau 120 giờ nuôi lắc ở nhiệt độ 28⁰C - 30⁰C, thu d ịch lên men, xác định HTKS bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.12 và hình 3. 12

Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi

trường lên men khác nhau

Chủng XK	Môi trường	Sinh khối (mg/ml)	HTKS (D-d,mm)
R2	A - 4H	8,34 ± 0,12	22,33 ± 1,42
	A - 4	4,6 ± 0,15	19,52 ± 0,48
	Gauze - I	5,51 ± 0,23	17,65 ± 0,58
	Gauze - II	7,52 ± 0,21	13,93 ± 0,13
	ISP - 4	3,19 ± 0,15	12,18 ± 0,15
Đ1	A - 4H	9,24 ± 0,23	21,34 ± 0,21
	A - 4	4,43 ± 0,18	18,72 ± 0,17
	Gauze - I	6,48 ± 0,33	16,23 ± 0,44
	Gauze - II	7,25 ± 0,22	9,14 ± 0,34
	ISP - 4	2,78 ± 0,26	7,25 ± 0,14


			$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image17.jpeg$

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image18.jpeg$ Hình 3.10: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tổng hợp CKS

Kết quả trên bảng 3.12 và hình 3.10 cho thấy: Trong 5 môi trường lên men cả 2 chủng nghiên cứu đều cho sinh khối lớn nhất trong môi trường A - 4H. Với chủng R2 là 8,0 mg/ml, chủng Đ1 là 9,0 mg/ml. Đồng thời d ịch lên men của môi trường A - 4H cũng có ho ạt tính kháng sinh mạnh nhất (21mm). Từ kết quả này đã chứng tỏ các thành phần trong môi trường lên men có ảnh hưởng nhiều đến khả năng hình thành CKS của xạ khuẩn như nhiều nghiên cứu trước đã khẳng định [14],[17].

Với mục đích là lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp CKS, căn cứ vào kết quả này chúng tôi nhận thấy môi trường A - 4H là thích hợp nhất và được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Các hợp chất cacbon vừa là nguồn dinh dưỡng lại vừa là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể. VSV nói chung và xạ khu ẩn nói riêng có khả năng sử dụng được nhiều nguồn cacbon khác nhau.

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tr ưởng và hình thành CKS, đồng thời xác định được nguồn cacbon thích hợp nhất cho 2 chủng R2 và Đ1, chúng tôi tiến hành khảo sát một số nguồn cacbon thông thường được sử dụng để lên men CKS.

Các chỉ	Ký hiệu	Nguồn cacbon
tiêu	chủng	Glucose	Tinh bột	Lactose	Sacarose
Sinh	R2	17,44 ± 0,22	16,23 ± 0,42	13,58 ± 0,56	18,93 ± 0,57
khối	Đ1	18,53 ± 0,45	15,75 ± 0,33	11,55 ± 0,15	17,26 ± 0,34
HTKS	R2	15,24 ± 0,36	18,21 ± 0,32	20,23 ± 0,61	21,22 ± 0,78
	Đ1	17,53 ± 0,16	16,82 ± 0,58	16,34 ± 0,74	18,29 ± 0,65

CKS của 2 chủng R2 và Đ1


	$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image19.jpeg$		$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image20.jpeg$

Kết quả trình bày trên bảng 3.13 cho thấy: cả 2 chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 đều có khả năng s ử dụng được cả 4 nguồn đường nghiên cứu. Tuy nhiên ảnh hưởng của các nguồn cacbon này lên sự sinh trưởng và khả năng tạo kháng sinh c ủa các chủng có sự khác nhau. Đối với chủng R2 nguồn cacbon sacarose cho sinh khối lớn nhất và HTKS mạnh nhất. Chủng Đ1 nguồn cacbon Glucose cho sinh khối lớn nhưng sacarose có HTKS mạnh nhất.

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS

3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ là nguồn dinh dưỡng không thể thiếu đối với VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Trong môi trường lên men, nguồn nitơ có ảnh hưởng nhiều đến sự tổng hợp CKS của xạ khuẩn [3].

Nguồn nitơ được sử dụng trong môi trường lên men xạ khu ẩn có thể ở dạng vô cơ ho ặc hữu cơ. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của cả 2 nguồn nitơ này đến khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS

của 2 chủng R2 và Đ1

	Nồng	Sinh khối		Ho ạt tính kháng sinh
Nguồn nitơ	độ	(mg/ml)		(D-d,mm)
	(%)	R2	Đ1	R2	Đ1
Bột đậu tươ ng	1	12,6 ± 0,25	11,2 ± 0,32	21,63 ± 0,58	20,32 ±0,15
Cao nấm men	1	13,52 ± 0,23	13,28 ±0,17	19,78 ± 0,26	19,73 ±0,52
(NH4)2SO4	1	9,73 ± 0,18	8,01 ± 0,22	17,65 ± 0,44	16,82 ±0,38
kno₃	1	7,82 ± 0,52	8,56 ± 0,24	16,92 ±0,32	14,34±0,17

Nguồn nitơ hữu cơ được chúng tôi sử dụng là cao nấm men và bột đậu tương, nguồn nitơ vô cơ là nitrat kali (KNO₃) và muối sunfat amon ((NHO2SO4).

Các nguồn nitơ này được bổ sung vào môi trường A - 4H. Quá trình lên men được tiến hành trong bình nón 250 ml có chứa 25 ml môi trường. Sau 120 giờ nuôi lắc, thu dịch lên men và xác định HTKS. Kết quả được trình bày trên bảng 3.14 và hình 3.12.

Từ kết quả trên cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều sinh trưởng tốt ở trong 2 môi trường có nguồn nitơ hữu cơ là bột đậu tương và cao nấm men. Song chưa rõ có sự khác nhau rõ rệt giữa 2 nguồn nitơ này.

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image21.jpeg$

Hình 3.12 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS

Cũng như sự sinh trưởng, HTKS của 2 chủng nghiên cứu cũng cao hơn ở trong 2 môi trường có bột đậu tương và cao nấm men. Các kết quả này đã khẳng định ưu thế của nguồn nitơ hữu cơ lên khả năng sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp CKS của xạ khuẩn nói chung. Điều này có thể giải thích trong các nguồn nitơ hữu cơ, ngoài thành phần protein còn chứa các chất cần thiết cho quá trình tổng hợp CKS. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả đã công bố trước đây [14].

3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử

3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA từ 2 chủng xạ khuẩn là Đ1 và R2. Trước khi tiến hành tách chiết DNA, các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường tăng sinh để thu sinh khối tế bào. DNA được tách chiết theo phương pháp của Ausubel và cs có cải tiến [39] đã

được trình bày ở trên. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% và được trình bày trong hình 3.13.

Đ1 R2

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image22.jpeg$

Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn

Trên cơ sở kết quả thu được trong hình 3.13 cho thấy DNA đã được tách ra từ cả 2 chủng xạ khuẩn nêu trên. Tương ứng với mỗi chủng, sản phẩm điện di chỉ có một băng duy nhất đã chứng tỏ DNA không bị đứt gãy trong quá trình tách chiết. Hàm lượng DNA thu được là tương đối lớn và có độ sạch cao. Như vậy, có thể nói rằng DNA thu được trong quá trình tách chiết đã đạt được các yêu cầu đề ra. Sản phẩm DNA đáp ứng tốt cho các nghiên cứu khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR.

3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR

Để tạo tiền đề cho việc định loại 2 chủng xạ khuẩn đã được phân lập nêu trên, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành khuếch đại gen 16S - rRNA. Đây là một gen chỉ thị được dùng phổ biến trong định loại VSV. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại cho phản ứng PCR cho phép khuếch đại trình tự trọn vẹn của gen 16S - rRNA, đảm bảo tốt cho các nghiên cứu tách dòng và

xác định trình tự đầy đủ của gen này. Kết quả khuếch đại gen được trình bày trong hình 3.14.

$Description: C:\Users\ADMINI~1.202\AppData\Local\Temp\FineReader12.00\media\image23.jpeg$

Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu

M. Maker 0X174 cắt bằng Hind III 3,4. chủng Đ1.

5,6. Chủng R2

Dựa trên kết quả điện di hình 3.14 cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 đều có sự nhân lên của gen 16S - rRNA. Sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao, không có các sản phẩm phụ. Mặt khác, dựa trên DNA maker chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết trong quá trình lựa chọn mồi. Như vậy có thể kết luận là đoạn DNA được nhân lên chính là gen 16S - rRNA. Kết quả này là cơ sở quan trọng để chúng tôi có thể tiếp tục tách dòng và xác định trình tự đầy đủ của gen 16S ở 2 chủng nghiên cứu.

Chương 4

KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KÉT LUẬN

1. Từ các mẫu đất khác nhau, đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. Trong số các chủng có hoạt tính kháng nấm, nhóm trắng chiếm 36,7%, xám - 26,7%, xanh - 23,3%, hồng - 6,7%, nâu - 3,3%, lục - 3,3%.

2. Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn là Đ1 và R2 có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, kháng được cả 2 chủng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên là CT - 2E và CT - 5X, đồng thời cũng có khả năng kháng các nấm kiểm định.

3. Đã tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khuếc h đại gen 16S - rRNA để nhận định:

- Chủng R2 có thể là loài Streptomyces misawaensis.

- Chủng Đ1 có thể là loài Actinomyces brunneofungus.

4. Đã xác định được một số điều kiện lên men thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn.

- Môi trường A - 4H thích hợp cho lên men tạo chất kháng sinh cho c ả 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2.

- Nguồn cacbon thích hợp nhất để tổng hợp CKS của chủng R2 là Sacarose và chủng Đ1 là glucose.

- Bột đậu tương và cao nấm men đều là những nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho lên men CKS của cả 2 chủng xạ khuẩn này.

4. 2. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

1. Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gene 16S của hai chủng xạ khuẩn Đ1 và R2.

2. Tiếp tục nghiên cứu khả năng tổng hợp CKS của hai chủng Đ1 và R2.

3. Tách chiết và xác định bản chất hóa học của các CKS.

4. Tìm hiểu khả năng ứng dụng của các CKS thô và cần được khảo nghiệm trên diện rộng để đánh giá hiệu quả sử dụng trong công tác bảo vệ thực vật.

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

Bùi Thị Hà, Vi Thị Đoan Chính (2008), "Khả năng kháng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Thái Nguyên", Tạp chí khoa học và công nghệ, số 2 (46), tr. 92 - 96.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (2006), Kỹ thuật trồng,chăm sóc và chế biến Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên, NXB Nông nghiệp, tr. 72 - 77.

2. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia, Hà Nội, tr.53 - 71.

3. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

4. Chi cục bảo vệ thực vật Phú Thọ, Sử dụng an toàn, hiệu quả thuốc bảo vệ thực vật trên cây Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên, 07/2003, tr. 24 - 30.

5. Nguyễn Hoàng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội.

6. Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội.

Tìm kiếm Blog này

Trà Tân Cương Thái Nguyên ngon nhất

Trà Tân Cương Thái Nguyên bị bệnh thu thập ở các khu vực khác nhau của tỉnh Thái Nguyên

Nhận xét

Đăng nhận xét

Bài đăng phổ biến từ blog này

Môi trường chính trị tương đối ổn định, sản xuất Chè Thái Nguyên

Thương hiệu và chất lượng sản phẩm Trà Thái Nguyên, trà lài Thái Nguyên