Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Vi Thị Đoan Chính đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơ n ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.
Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Ngô Đình Quang Bính và các cán bộ phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơ n các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm lu ận văn.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những người thân yêu của tôi.
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chua từng đuợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008 Tác giả
T rang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục
Những chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn.......................................................... 4
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn....................................................... 5
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn.............................................................................. 6
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI............................. 8
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa................................................................... 10
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)..................................................... 10
1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN................................................................. 12
1.3.1. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh.................................................... 12
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh................ 16
1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ THÁI NGUYÊN, CHÈ TÂN CƯƠNG THÁI NGUYÊN, TRÀ THÁI NGUYÊN, TRÀ TÂN CƯƠNG THÁI NGUYÊN DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA
CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT................................................................... 18
1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật......................................... 21
Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu 24
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị................................................................ 24
2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski............................................... 28
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh.......................................................... 28
2.2.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh............................................................................... 29
2.2.3. Bảo quản giống 29
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn........................... 30
2.2.4.1. Đặc điểm hình thái 30
2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy 31
2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.............................................................. 31
2.2.5.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp......................................... 32
2.2.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.......................................................... 33
2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ............................................................... 33
2.2.6. Các phương pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA....33
2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB............................ 33
2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR.............................. 34
2.2.6.3. Phương pháp điện di trên gel agarose............................................................................................................ 35
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................. 36
Chương 3 - KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2....42
3.3.1. Đặc điểm hình thái................................................................................. 42
3.3.2. Đặc điểm nuôi cấy 43
3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.................................................................. 45
* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon........................................................ 45
* Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp..................................................................... 46
* Khả năng chịu muối....................................................................................... 46
* Khả năng sinh enzym ngoại bào.................................................................. 47
3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1...................................... 48
3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1............................ 50
3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn................... 52
3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.............................................................. 54
3.4.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ.................................................................... 56
3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn................ 57
3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR........................... 58
Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo................................................ 61
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN........................................ 62
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
XK | : Xạ khu ẩn |
VSV | : Vi sinh vật |
CKS | : Chất kháng sinh |
HSCC | : Hệ sợi cơ chất |
HSKS | : Hệ sợi khí sinh |
KTKS | : Khuẩn ty khí sinh |
HTKS | : Hoạt tính kháng sinh |
HTKN | : Hoạt tính kháng nấm |
MT | : Môi trường |
KHVQH | : Kính hiển vi quang học |
KHVĐT | : Kính hiển vi điện tử |
DNA | : Deoxyribonucleic Acid |
RNA | : Ribonucleic Acid |
ISP | : International Streptomyces Project |
TE | : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid |
SDS | : Sodiumdodecyl sulfat |
TAE | : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid |
PCR | : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) |
|
Trang
Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên làm nguồn phân lập các chủng nấm 37
Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu................................... 39
Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên................................. 40
Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn............................................. 41
Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1..................................................... 44
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2....45
Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1............................. 46
Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1............................................... 47
Bảng 3.9. Ho ạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm định 48
Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis....50 Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu. 52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trường
lên men khác nhau........................................................................................................... 53
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS
của 2 chủng R2 và Đ1..................................................................................................... 55
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 56
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên bị bệnh............................................................. 38
Hình 3. 2 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu........ 39
Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm.................................... 40
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn............................... 42
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2............................................ 42
Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1........................................... 43
Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng...................................... 44
Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn................................................... 47
Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2....49
Hình 3.10: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tổng hợp CKS........................ 54
Hình 3.11: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS.................. 55
Hình 3.12 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS....................... 57
Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn..................................... 58
Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.............. 59
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái.
Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của F AO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh.
Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên ở Thái Nguyên ".
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có ho ạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có ho ạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng.
3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài
* Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên.
- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên ở Thái Nguyên.
* Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây Chè Thái Nguyên, Chè Tân Cương Thái Nguyên, Trà Thái Nguyên, Trà Tân Cương Thái Nguyên để sử dụng làm VSV kiểm định.
2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ các mẫu đất khác nhau.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn.
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [43].
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trườn g, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium... Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi.
Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, amylaza, xenluloza... một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [7].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 1 mđến2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22],
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ
quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng.. .tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm.
Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 2 mm nhưng cũng có khuẩn
lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn.
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ.. .có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường.
* Khuẩn ty
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng.
Độ dài của khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 m/giờ [43] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi. Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy sợi được hình thành và phát triển. Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên trong chứa các bào tử nang [7].
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn
Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh s ản đặc trưng cho xạ khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn.
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [9].
Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 400 A° chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào
tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH...Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất định khi nuô i cấy trên mô i trường có nguồn nitơ khác nhau [13].
Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm. Trong nhiều trường hợp khi kích thích sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi.
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:
Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 120A°, khi già có thể đạt tới 150
200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamm liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit. Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30], [32], [35] [36].
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [6], [8].
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic, arabinose và galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol).
Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [11],
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [3].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn.. .Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học...nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh...Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định lo ại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử.
Theo Pridham và cộng sự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng. RA cho những cuống sinh bào tử xo ắn, thô sơ và ng ắn. S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xo ắn.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn d ịch học hay sinh học phân tử [45].
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào.
- Typ peptidoglycan (PG) d ựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG.
- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter. Đây là đặc điểm phân lo ại cơ bản cho các chi đó.
- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit (axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [11].
- Photpholipit có 5 typ photpholipit (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.
Trong phân loại xạ khu ẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất. Khi muốn đưa ra một loài mới ho ặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào.
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, ngườ i ta sử dụng hàng lo ạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác như kh ả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý - sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá tr ị thấp về mặt phân lo ại. Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi [29].
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số.
Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa.
Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng.
- Công thức của Sokal và Michener (SSM)
 | |||||
 | |||||
 | |||||
Trong đó: SM : Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%)
NS+: Số các tính trạng giống nhau Nd: Số các tính trạng khác nhau NS-: Số các tính trạng đối lập nhau.
- Công thức của Jacard (Sj)
N
s* , ——— 100
“ Ns Na
Trong đó: S : mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%)
(AB
NS: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng
so sánh.
Nd: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia).
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu "rễ cây") của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất định [44].
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt tên năm 1943 [43]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 pm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính kho ảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề
mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng ...
Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 pm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn.. .tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuô i cấy.
Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 300C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn ho ặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [48],[49].
Theo định nghĩa của Outchinnikov [48]. Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp.
Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10 năm 1928.
Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và trở thành "một loại thuốc thần kỳ". Năm 1945, A.Fleming, E. Chain và H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học - kỷ nguyên kháng sinh.
Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với hàng lo ạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin, tiroxidin do Rene Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm 1941, erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952... Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men s ản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện [31].
Ngay từ nh ững năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới có giá tr ị ứng dụng trong thực tiễn.
Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có ho ạt tính chống nấm gây bệnh mạnh. Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312.
Năm 2003, nhiều nước trên thế giớ i vẫn tiếp tục phát hiện được hàng lo ạt các CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP - A0356 bằng phương pháp sắc kí cột. CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư với giá tr ị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml [15].
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [47].
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các lo ại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [7],[41].
Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN, kỹ thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những đem lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS.
1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [6].
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ xạ khu ẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khu ẩn.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng [5].
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định.
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym.
- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau.
- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
1.3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
* Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn. Đa s ố các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 300C, nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong kho ảng 18 - 280C [20].
* pH môi trường
Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường. pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến ho ạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường. pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [24],[46].
* Độ thông khí
Xạ khuẩn là lo ại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy)[21]. Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat... làm tăng khả năng hòa tan oxy. Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 - 8ml O2/ 100ml môi trường lên men [8].
* Tuổi giống
Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thường là 24 giờ tuổi. Lượng giống cấy truyền kho ảng từ 2 - 10% [14].
I.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
CKS là sản phẩm trà Tân Cương Thái Nguyên thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng. Trước hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng...[5],[26],[29].
* Nguồn cacbon
Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành CKS. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các lo ại đường đơn như glucoza, mannoza, fructoza...có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như sacaroza, maltoza...Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các lo ại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS.
* Nguồn nitơ
Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô. Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao s ẽ ức chế sinh tổng hợp CKS[27]. Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon. Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
* Nguồn photphat vô cơ
Photphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS. Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá 10 mg/ml. Nồng độ photphat ban đầu cao s ẽ làm t ăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến giảm ho ặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS.
* Các yếu tố vi lượng
Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men. Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn. Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
* Hình thức lên men
Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan sát thấy và CKS được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng. Quá trình sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy đảo và sục khí.
Nhận xét
Đăng nhận xét